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啤 酒 生 产 常 见 微 生 物 的 营 养 需 求
马胜平    2006-07-25 浏览量:29

自然界中存在着大量的生物,其中有许多肉眼看不见或看不清的微小生物,我们把它们总称为微生物(microorganism,  microbe)。啤酒生产企业常见的微生物种群并不多,主要是酵母菌类和细菌类,少数为霉菌。酵母菌和霉菌类属于真核生物,细菌属于原核生物,这是它们的本质区别,也决定了它们表现出的生理活性状态的千差万别。
营养,或者称为营养作用,是指生物体从外部环境摄取其生命活动所必需的能量和物质,以满足其生长和繁殖需要的一种生理功能。所以营养为一切生命活动提供了必需的物质基础,它是一切生命活动的起点。有了营养,才可以进一步进行代谢、生长和繁殖,并可能为人们提供种种有益的代谢产物。
营养物是指具有营养功能的物质,在微生物学中,常常还包括光能这种非物质形式的能源在内(此处不予讨论)。微生物的营养物可为它们正常生命活动提供结构物质、能量、代谢调节物质和良好的生理环境。
从微生物分类中的异养型微生物来考察,营养物的种类不超出碳源、氮源、生长因子、无机元素和水等五大类。碳源就是为微生物提供营养所需的碳元素及代谢能量的营养源,包括有机碳源的复杂蛋白质和核酸等,反映在实验室培养基的成分上就是牛肉膏、蛋白胨、一般的氨基酸、明胶、葡萄糖、蔗糖等。氮源就是微生物提供营养所需的氮元素的营养源,包括有机氮的蛋白质、核酸、氨基酸、尿素等,反映在实验室培养基的成分上就是牛肉膏、酵母膏、蛋白胨、明胶等。生长因子是一类对微生物正常代谢必不可少且不能用简单的碳源或氮源自行合成的有机物,它的需要量一般很少。广义的生长因子包括维生素、碱基、卟啉及其衍生物、甾醇和胺类。无机元素和水相对比较好理解,不赘述。
啤酒生产中常见的微生物,其营养物的来源不外乎半成品(包括麦汁、发酵液和清酒)或成品的啤酒。而从比较的角度来说,半成品特别是麦汁的营养物组分更丰富一些。所以一般来讲,在啤酒企业进行发酵工序微生物的常规检测时使用麦汁进行基本配料就可以了,再根据固体、半固体或液体培养基的需要在其中加入或多、或少或不加琼脂,根据啤酒酵母生长抑制的需要加入放线菌酮等生物素。但在进行生产现场微生物状态评估时,需要使用一些较为特殊的培养基。
按照德国Back教授的微生物控制理论,可以习惯的将微生物分为以下几大类:
啤酒有害责任菌——不需要较长的适应期就能在啤酒中生长,具有啤酒高选择性的条件,如低值、厌氧环境、酒花苦味物质、营养和生长基质缺乏等。可以通过代谢产物的口感和风味或代谢产物引起的混浊和沉淀造成啤酒的视觉变化等对啤酒产生危害性。
潜在的啤酒有害菌——在满足一定条件时才能在啤酒中生长,危险仅存在于当太高、酒花含量较低、发酵度低、氧含量高、酒精含量较低时的情况,经过一段较长的适应期后,会表现出对啤酒的危害性。
间接啤酒有害菌——对啤酒无害,但在满足一定条件的啤酒中生长,会引起令人讨厌的预破坏,并最终产生对啤酒的负面影响。
指示菌——对啤酒无害,但经常与啤酒有害菌共生,且容易被检测到。
潜伏菌——对啤酒无害,但具有广泛的分布性,能够对啤酒造成短期污染。
可以看出上述分类的一个潜在信息就是我们不需要将啤酒厂建成百级无菌室,对啤酒没有直接危害的微生物可以允许其存在。但是从目前条件来讲,用较常规简便的手段又无法将有害责任菌与无害菌进行严格的检测区分,(各种报道的快速检测方法都不现实,要么太贵、要么灵敏度不够、要么太繁琐,)也就是说不能对有害责任菌进行针对性的控制,即仍然要以广泛的微生物控制来达到保证产品微生物稳定性的目的要求。
那如何对微生物状态进行广泛控制呢,我认为经济合理的方法只有一个:就是保持相对的无菌状态,其中包含两点——控制微生物传播渠道和消除微生物滋生环境。
关于控制微生物传播渠道方面,我在早期的文章中有所论述,而消除微生物滋生环境则说起来非常简单,就是消除一切卫生死角。但如何有效地对消除死角后的环境卫生状态进行评估呢?
NBB系列培养基,可以用来鉴定啤酒有害菌,其配方主要是以啤酒为基体,有类似啤酒的生存条件,并能预防非啤酒有害微生物的生长。为了提高微生物鉴定的灵敏度,还加入了酵母浸膏、牛肉浸膏、葡萄糖、麦芽糖、L-苹果酸等营养物质。用于灌装区微生物状态评估擦拭用NBB肉汤培养基(即NBB-B),为了抑制酵母生长,NBB肉汤培养基中还加入了放线菌酮;为了显示产酸特性,加入了氯苯酚作为指示剂。
NBB-B在灌装区的应用非常简单:用无菌棉签擦拭需检定的环境设备表面,然后放入培养基中26℃培养三天,若有酸性菌株污染,指示剂由红变黄;一天之后颜色发生变化表明污染严重,两天之后颜色变化表明轻度污染,三天之后颜色变化表明零星污染。
我认为,利用NBB-B培养基与NBB-C(NBB浓缩培养基)相结合的办法用于微生物的非常规鉴定分析应该用处更大,但使用在灌装区卫生状态评估上就暴露出几个不足:1、用于结果判别的检定时间太长;2、费用较高;3、检测灵敏度仍然不足。
对NBB-B培养基进行简单分析发现,在单纯的擦拭应用上其变色pH值约在4.8左右(加上该培养基的胶体性质,存在一定的缓冲性,使得变色反应更加迟缓),而且检测出的微生物也存在上述分类中的多样性。因此,基于检定微生物的产酸特性,将生产环境保证在相对无菌状态下的控制理念,我试验使用了几种新的配方培养基,其基本特点就是营养条件相对全面、反应更加灵敏(变色显示pH值在5.7左右)、结果显示更加直观明确,其试验结果见下表。
     从普通包装车间灌装区排水沟中取样,分别按不同比例随机稀释后制成试验样品1、2、3、4,分别取一滴加入不同试验培养基中,27℃培养:
项目 时间
 16hour 24hour 40hour 48hour 64hour 72hour

(A)
1%葡萄糖+甲基橙+营养培养基 1 浑浊,起大量泡 浑浊,起大量泡 浑浊,起大量泡 浑浊,起大量泡(1) 浑浊,起少量泡(2) 浑浊,起少量泡(2)
 2 浑浊,起少量泡 浑浊,起泡 浑浊,起泡 浑浊,起泡(1) 中浑浊,起少量泡(3) 中浑浊,起少量泡(3)
 3 浑浊,起少量泡 浑浊,起少量泡 浑浊,极少量泡 浑浊,极少量泡(1) 浑浊,极少量泡(1) 浑浊,极少量泡(1)
 4 无变化 无变化 浑浊,起少量泡 浑浊,起少量泡(1) 浑浊,起极少量泡(1) 浑浊,起极少量泡(1)
(B)
溴甲酚紫+营养培养基 1 微浑 微浑,极少量泡 微浑,极少量泡 浑浊,极少量泡(1) 浑浊,极少量泡(1) 浑浊,极少量泡(1)
 2 微浑 微浑,无泡 微浑,无泡 微浑,无泡(2) 浑浊,极少气泡(1) 浑浊,极少气泡(1)
 3 微浑 微浑,无泡 微浑,无泡 微浑,无泡(3) 浑浊,极少气泡(1) 浑浊,极少气泡(1)
 4 无变化 无变化 无变化 无变化(4) 无变化(2) 无变化(2)
(C)
0.5%乳糖+0.5%葡萄糖+溴甲酚紫+营养培养基 1 变黄,起大量泡 变黄,起大量泡 变黄,起少量泡 变黄,起少量泡(2) 变黄,起少量泡(1) 变黄,起少量泡(1)
 2 中变黄,起少量泡 中变黄,起泡 变黄,起大量泡 变黄,起大量泡(1) 变黄,起大量泡(2) 变黄,起大量泡(2)
 3 中变黄,起少量泡 中变黄,起少量泡 中变黄,起大量泡 变黄,起大量泡(3) 变黄,起大量泡(3) 变黄,起大量泡(3)
 4 无变化 无变化 中变黄,极少量泡 中变黄,极少量泡(4) 中变黄,极少量泡(4) 中变黄,极少量泡(4)
(D)
1%乳糖+溴甲酚紫+营养培养基 1 中变黄,大量泡 变黄,极大量泡 变黄,起泡 变黄,起泡(3) 变黄,起少量泡(1) 变黄,起少量泡(1)
 2 微变黄,起少量泡 轻变黄,起泡 变黄,极大量泡 变黄,极大量泡(1) 变黄,极大量泡(2) 变黄,极大量泡(2)
 3 微变黄,起少量泡 轻变黄,起泡 中变黄,起泡 中变黄,起泡(2) 中变黄,起泡(3) 中变黄,起泡(3)
 4 无变化 无变化 无变化微浑 无变化微浑(4) 无变化微浑(4) 无变化微浑(4)
(E)
NBB-B 1 无变化 轻变黄,起泡 中变黄,起少量泡 中变黄,起少量泡(1) 中变黄,起少量泡(1) 中变黄,起少量泡(1)
 2 无变化 无变化 中变黄,无泡 中变黄,无泡(3) 中变黄,无泡(2) 中变黄,无泡(2)
 3 无变化 无变化 中变黄,起少量泡 中变黄,起少量泡(2) 中变黄,起少量泡(3) 中变黄,起少量泡(3)
 4 无变化 无变化 无变化 无变化(4) 无变化(4) 无变化(4)
(F)
营养琼脂培养基(极多,多,较多,较少,少,极少) 1 细菌极多 细菌极多 细菌极多 细菌极多(1) 细菌极多(1) 细菌极多(1)
 2 细菌多 细菌多 细菌多 细菌极多(1) 细菌极多(1) 细菌极多(1)
 3 细菌多 细菌多 细菌多 细菌极多(1) 细菌极多(1) 细菌极多(1)
 4 细菌极少 细菌极少 细菌极少 细菌极少(2) 细菌极少(2) 细菌极少(2)
附:程度等级有极大(极多)、大(多)、较大(较多)、较少、少、极少;变黄、中变黄、微变黄、无变化;浑浊、微浑
从表中可以看出,酸性指示剂溴甲酚紫比甲基橙具有更加明显的变色显示特性,乳糖和葡萄糖均能够为部分微生物的生长提供碳源和能源。但对培养结果进行显微镜观察时,发现(C)、(D)两个配方培养基中的微生物种类存在差别,分别对培养结果进行固体培养基表面培养观察,进一步验证两者的差别性,其中(C)配方培养基基本可以达到实验设计的目的要求。
进一步试验查找乳糖和葡萄糖两种碳源的合适比例,营养琼脂和溴甲酚紫使用方式不变,试验样品制备方式不变,乳糖和葡萄糖按下表中量进行比例添加,(注意:为保证微生物生长所需的广谱生长因子和无机元素,并且使得培养基更具有实效性,建议配制用水采用当地的地表自来水。)结果如示:
                         项目 时间
 16hour 24hour 40hour 48hour
0.1%葡萄糖+0.9%乳糖 1 浑浊,无变色 浑浊,无变色,少量气泡 浑浊,无变色,少量气泡 浑浊,无变色,少量气泡
 2 无变化 微浑 微浑 微浑,无泡
 3 无变化 无变化 无变化 无变化
 4 无变化 无变化 无变化 无变化
0.2%葡萄糖+0.8%乳糖 1 浑浊,颜色微变 浑浊,颜色微变 浑浊,颜色变 浑浊,颜色变
 2 无变化 无变化 无变化 浑浊,颜色微变
 3 无变化 无变化 无变化 无变化
 4 无变化 无变化 无变化 无变化
0.4%葡萄糖+0.6%乳糖 1 浑浊,颜色变黄 浑浊,颜色变黄 浑浊,颜色变黄 浑浊,颜色变黄
 2 微浑浊,颜色变黄 浑浊,颜色变黄 浑浊,颜色变黄 浑浊,颜色变黄
 3 清亮,颜色变黄 清亮,颜色变黄 微浑浊,颜色变黄 浑浊,颜色变黄
 4 无变化 无变化 无变化 清亮,颜色变黄
0.8%葡萄糖+0.2%乳糖 1 浑浊,颜色变黄 浑浊,颜色变黄 浑浊,颜色变黄 浑浊,颜色变黄
 2 无变化 无变化 无变化 无变化
 3 无变化 无变化 无变化 无变化
 4 微浑浊,颜色变黄 浑浊,颜色变黄 浑浊,颜色变黄 浑浊,颜色变黄
1%葡萄糖 1 浑浊,颜色变黄 浑浊,颜色变黄 浑浊,颜色变黄 浑浊,颜色变黄
 2 无变化 无变化 无变化 无变化
 3 无变化 无变化 无变化 无变化
 4 无变化 无变化 无变化 无变化
营养琼脂培养基 1 大量菌落 大量菌落 / /
 2 少量菌落 少量菌落 / /
 3 少量菌落 少量菌落 / /
 4 少量菌落 少量菌落 / /
NBB-B 1 浑浊,变黄 浑浊,变黄 浑浊,变黄 浑浊,变黄
 2 无变化 无变化 无变化 无变化
 3 无变化 无变化 无变化 无变化
 4 无变化 无变化 无变化 无变化
   附:程度等级有极大(极多)、大(多)、较大(较多)、较少、少、极少;变黄、中变黄、微变黄、无变化;浑浊、微浑
从表中可以看出,按约1:1的比例配置乳糖和葡萄糖可以达到很好的检测结果,而且从实验反应速度看大量微生物污染时可以在16小时内反映出来,能够很好的对生产过程中的卫生清洗工作进行指导。


备注:作者——马胜平,福建省燕京惠泉啤酒股份有限公司技术二部副经理,公司中级工程师A类,论文发表于《啤酒科技》2006年第五期。

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